2019年10月1日，5-羟甲基（jī）化胞嘧啶（5-hydroxymethylcytosine，5hmC）在糖尿病研究领（lǐng）域（yù）取（qǔ）得重（chóng）要进展（zhǎn）。2型糖尿病（T2D）的血管并发（fā）症是导致2型（xíng）糖尿病致残致死的重要（yào）病因，一（yī）直缺乏一种（zhǒng）无创便捷的临（lín）床途径实现血（xuè）管并发症（zhèng）的发生发展监测，达到早发现、早干预，以提高T2D病人的整体生活质量，减少卫生经济（jì）负担。

该研究入（rù）组了（le）62例2型糖尿病病人，采用（yòng）5hmC-Seal技术对（duì）血浆cfDNA中表观遗传（chuán）标志物5hmC的分布情况进行（háng）检测（cè），分析5hmC标（biāo）志物（wù）与2型糖尿病血（xuè）管（guǎn）并发症发生发展的（de）相（xiàng）关性。结果表明5hmC标（biāo）志物的变（biàn）化与T2D合并大血管（guǎn）/微血管事件具有（yǒu）相（xiàng）关性，主要涉及一（yī）些与血管生物（wù）学和糖（táng）尿病（bìng）（包括（kuò）胰岛素耐受和（hé）炎症反应）相关的（de）基因和信号通（tōng）路。该研究（jiū）建（jiàn）立（lì）的（de）16个基因-5hmC标志物组合检测可以准确区分有并发症和无并发症的2型糖尿病（bìng）病人（rén）[实验（yàn）组：AUC=0.85；95% CI，0.73-0.96]，明显优于传统临（lín）床变量（liàng）例如白（bái）蛋白尿。除此之（zhī）外，还建立了13个基因-5hmC标志物组合检（jiǎn）测（cè），可以进一步区（qū）分T2D合并单（dān）一（yī）并（bìng）发症和多（duō）种并发症[实验组：AUC=0.84；95% CI，0.68-0.99]，同样（yàng）明（míng）显（xiǎn）优于（yú）其他传统临床变量。该研（yán）究得（dé）出结论（lùn），5hmC标志物反（fǎn）映（yìng）了（le）T2D病人大血（xuè）管/微血管并（bìng）发（fā）症发生过程中的（de）表（biǎo）观遗传变化，因（yīn）而5hmC-Seal检测技（jì）术在监测糖尿（niào）病（bìng）血管并发（fā）症发生和（hé）进展方（fāng）面具有良（liáng）好（hǎo）的（de）临床应用前景。

本研究（jiū）共纳入（rù）62例2型糖（táng）尿（niào）病病（bìng）人，包括没有血管并发症（zhèng）的病人12例，有单一血（xuè）管并发症的（de）病人34例（24例（lì）发生（shēng）大血管事件（jiàn），10例发生（shēng）微血管事件），以及（jí）有多种血管并（bìng）发症的病人16例。试验收集62例病人血浆，提取cfDNA，利用5hmC-Seal技术捕（bǔ）获（huò）外（wài）周血cfDNA中（zhōng）的5hmC序列，进行（háng）二代测序，通过生物信息学分（fèn）析找出（chū）并发（fā）症组与无并发症（zhèng）组（zǔ）之间有显著5hmC修饰差异的基因，单一并发症组和（hé）多种并发症组之间有显著（zhe）5hmC修饰（shì）差异的基（jī）因。随后利用回归模型对差（chà）异基因进一步（bù）筛选、优化，弹性网络（luò）进一步筛选，计算加权平均（jun1）分，最后得到（dào）一组具有高度灵敏度和特异性的（de）5hmC生（shēng）物标（biāo）记（jì）物，并进一步在实验组中（zhōng）验证，分析其灵（líng）敏度和（hé）特异性。并（bìng）将新建立的5hmC标志物基因组合的（de）检（jiǎn）测性能与传统临床变（biàn）量进行对比分（fèn）析。最后对相关（guān）基因（yīn）进行（háng）了信号通路分（fèn）析和功能探究。

5hmC修饰水平与血管并发（fā）症具有相关性

利用逻辑（jí）回归模型对62例有并发（fā）症和（hé）无并发症2型糖尿病病人的（de）5hmC差异水平（píng）进行分析发现，有并发症2型（xíng）糖（táng）尿病病人的622个差异修饰候选基因（包（bāo）括（kuò）上（shàng）调和下调基因）的（de）归一化平均数要（yào）明显高于无并发症的病人（P<0.001），但是单一并发症和多发并发（fā）症（zhèng）病（bìng）人之间没（méi）有显著差异。

之后将（jiāng）有单一并发（fā）症或多种并发症的50例病人用逻辑回归模型进行了对（duì）比，发现多种并发症（zhèng）的病人的（de）153个差异修饰候（hòu）选基因（包括上调和下调基因）的归一化平均数要低于无（wú）并发症病人（P<0.001）。

5hmC标志物可区分有（yǒu）无并发（fā）症患者

62例2型糖尿病病人被随机分成训（xùn）练组（zǔ）（n=31）和（hé）测试组（n=31）。利（lì）用（yòng）弹性网（wǎng）络筛选（xuǎn）后发现，16基因（yīn）-5hmC标志物（wù）组合检测（cè）可（kě）以用于区分有并（bìng）发症和无（wú）并发症的2型糖尿病病人。

基于16基因（yīn）组合模型 (Detection Model 1) 的（de）加权平均分（fèn）分析，发（fā）现（xiàn）无（wú）并发（fā）症病人的（de）分数在训练集和测试集中都明（míng）显低于有并发症的病人（rén）。只考虑加（jiā）权（quán）平（píng）均分的话，受试者（zhě）工作特（tè）征曲线（ROC）分析表明将cutoff值设置成0.5时，在测试组中中的灵敏度为60%，特异（yì）性为100%。

5hmC标志物（wù）可区分病人是单（dān）一并发症还是（shì）多种（zhǒng）并发（fā）症

50例有并发（fā）症的2型糖尿病病（bìng）人（rén）被随机分（fèn）成（chéng）训练组（n=25）和测（cè）试组（n=25）。利用弹性网络筛选后发现，13基（jī）因（yīn）-5hmC标志物组合可（kě）以（yǐ）区分2型糖尿病病（bìng）人是（shì）否发（fā）生单一（yī）并发症或多种并发症（zhèng）。

基于13基因组合模型 (Detection Model 2)， 我们计算（suàn）了（le）单一并发症和多种并发症的加权平均分，发现在训练集和测（cè）试集中单一并（bìng）发症和多种（zhǒng）并发症病人（rén）的分数都有明显差异。值得一提的是，有肾（shèn）病并（bìng）发症和无（wú）肾病并发（fā）症（zhèng）病人的分（fèn）数（shù）也有（yǒu）明（míng）显（xiǎn）差异。利用加权平均分作（zuò）为（wéi）判断标准的受试者工作特征曲线（ROC）表（biǎo）明，在测试组中当将（jiāng）cutoff值设成（chéng）0.69时，灵敏度为87.5%，特异性为68.8%。

5hmC标志物与传统临床（chuáng）变量/危险因子的对比

我们评估了不同（tóng）临床变量/危险（xiǎn）因子用（yòng）于监测（cè）血管并发症的灵敏度（dù）和特（tè）异性（见表1）。

信（xìn）号（hào）通路分析和功能探究（jiū）

有并发症和无并发症病（bìng）人的135个差异候选基因（yīn）的功（gōng）能注释（shì）分析表（biǎo）明，这些基因（yīn）主（zhǔ）要富（fù）集在一些经（jīng）典的信号通（tōng）路。错（cuò）误发现率相关P值（zhí）位于前（qián）10%和基因数目≥3的信号通路包括由IGF1R, IL-10和FGFR2所介导的信号通路。由IGF1R和IL-10介导的信号通路与（yǔ）胰岛素（sù）抵（dǐ）抗（kàng）及炎症反（fǎn）应相（xiàng）关，在血管生物学和糖尿病（bìng）发（fā）生（shēng）发展过（guò）程中发挥重要作用。

Reactome相互作用网络的中心表明，泛素编（biān）码基因[泛素B (UBB)，泛素C (UBC)，泛素A-52亚基（jī）核糖体蛋白融（róng）合产物1(UBA52)]是候选基因（如SMAD3, FOXD2, DRAP1, MCIDAS, MLN, PIANP和TBCC）的重要连接者。在这135个差异（yì）候选基因中, 一些基因（yīn） （如TNFRSF25，P=0.027, HR=6.25; MLN, P=0.0021, HR=20.40; CCL3L1, P=0.018, HR=0.44）表现（xiàn）出与糖尿病（bìng）病程相关的倾向，表（biǎo）明（míng）5hmC和糖尿病血管并（bìng）发症之间可能（néng）存在时间依赖性的相互作（zuò）用。基于纵向时间（jiān）队列的大样（yàng）本研究，将可进一步明确5hmC变化和糖尿病持续时间之间的动（dòng）态关联。关于单一并发（fā）症（zhèng）和多（duō）种并（bìng）发症病人的159个候（hòu）选标志基因的功能注释研究发现（xiàn），存在（zài）细胞（bāo）-细胞连接、胶（jiāo）原蛋白形（xíng）成（chéng）、新（xīn）陈代谢、细胞应激应答信（xìn）号通路的富集，这些信号通路均与（yǔ）细胞基本功能密切相关。

血管并发症是（shì）三分（fèn）之二糖尿病病人的死亡原因（yīn），若能及早有效控制血管并发（fā）症的发生，将极（jí）大地改善糖尿（niào）病病人的（de）生存质（zhì）量（liàng）。该研究建立了一种利（lì）用cfDNA进行2型糖尿病血管并（bìng）发症监测的（de）无创便捷方法，较目前临床标志物能更准确地监控血管并发症的发生，从而提示临床（chuáng）及（jí）早采取应对措施，有效（xiào）控制病情进（jìn）展。